자외선 B 조사한 HaCaT 세포에서 세포자멸사 관련 유전자 발현

Abstract

피부는 자외선에 장시간 반복적으로 노출되면 일광화상, 광노화, 색소 침착 그리고 피부암 발생이 증가하게 되는데, 이 중 유전자 손상이 심한 세포는 세포자멸사 기전에 의해 제거되는 것으로 알려져 있다. 세포자멸사와 관련된 유전자에는 세포자멸사를 촉진하는 단백질로 Bax, caspase-3 및 Bad 등이 있고, Bcl-XL, Bcl₂는 세포자멸사를 억제한다. 이러한 세포자멸사과정을 조절하는 인자들 사이에 균형이 무너져 세포자멸사 억제인자가 비정상적으로 과도하게 작용하게 되면, 비정상적인 세포가 피부암으로 진행하게 됨이 보고 되어 있다. 이 연구는 자외선 B에 의해 손상 받은 세포의 세포자멸사 기전을 규명하고자, 인체 각질형성 세포(HaCaT cell)에 자외선 B를 조사하여 세포자멸사를 유도하고, 세포자멸사가 유도된 세포에서 세포 증식능의 측정, FACS (fluorescence Activated Cell Sorter) 분석, PI (propidium iodide) 염색, DNA 분절 분석을 통해 세포자멸사 정도를 평가하였다. 이 과정에서 유도되는 cytochrome C, capase-3, 8 및 9의 발현양상, Bax, Bcl-XL, 및 Bcl₂의 발현양상은 Western blot을 통해 확인하였으며, Bcl-XL 및 Bcl₂ mRNA의 발현은 RT- PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction) 기법을 사용하여 분석하였다. 자외선 B를 조사한 HaCaT 세포에서 200 mJ/㎠에서부터 증식능은 현저히 감소하였고, 자외선 B 400 mJ/㎠ 조사한 경우 FACS 분석에서 세포자멸사 과정 중 증가하는 sub-G1 비율의 증가, PI 염색 상 핵의 분절현상, 그리고 DNA 분절 분석에서 DNA 분절현상이 관찰 되었다. Western blot 분석 상 cytochrome C 증가 및 caspase-3, 8, 9의 전구 단백질 발현이 감소하였다. 또한 Bax, Bcl-XL 및 Bcl₂의 발현양상을 Western blot을 통해 분석한 결과, Bax의 발현은 미미하게 증가된 발현양상을 보인 반면, Bcl-XL 은 낮은 UVB 강도인 100 mJ/㎠에서부터 현저히 발현이 감소하였고, Bcl₂ 는 300 mJ/㎠에서부터 서서히 발현이 감소하였으며, Bcl-XL 및 Bcl₂ mRNA의 발현 변화는 관찰할 수 없었다. Proteasome의 기능을 억제하는 억제제 (MG132)를 HaCaT 세포주에 자외선 B와 함께 처치 한 결과, 자외선 B에 의한 Bcl-XL의 발현 감소가 둔화됨을 확인하였다. 이상의 결과는 자외선 B 조사 시 caspase-3, 8 및 9의 활성화 및 Bcl₂ 및 Bcl-XL 발현감소를 통하여 세포자멸사 과정이 진행되며, 세포자멸사 억제 인자 중 Bcl-XL이 Bcl₂ 보다 더 현저하게 감소함을 확인하였으며, 이러한 기전은 자외선에 의해 손상 받은 세포에서 피부암 발생을 근원적으로 차단하고자 하는 세포자멸사의 분자 생물학적 조절기전을 이해하는데 중요한 기초 자료가 될 것으로 생각한다.

Excessive ultraviolet B (UVB) radiation induces apoptosis of keratinocytes through inbalance between pro-apoptotic proteins (Bax, caspases and Bad) and anti-apoptotic proteins (Bcl₂, Bcl-XL). Failure to remove the UVB-induced apoptotic cells by apoptosis can lead to development of the skin cancer. So, to understand the carcinogenesis by UVB in skin, it is important that analyzing the expressions of apoptosis related genes in skin following UVB irradiation. In this study, to investigate the expressionof apoptosis related genes in UVB-irradiated HaCaT keratinocytes., cells were irradiated with UVB at various doses (0, 100, 200 and 400 mJ/㎠). The apoptotic cell death was confirmed by flow cytometric analysis, detection of apoptotic nuclei, and DNA laddering assay. The expressions of genes were analyzed by RT-PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction) and Western blot analysis. This study showed the DNA fragmentation concomitantwith increased Sub-G1 fraction of cells were clearly observed in UVB (400 mJ/㎠)-irradiated HaCaT cells. Increased expressionsof cytochrome C and activations of caspase-3, 8, 9 were confirmed in UVB-irradiated HaCaT cells by Western blot. The anti- apoptotic proteins, Bcl-XL and Bcl₂, were decreased by UVB irradiation at 100 mJ/㎠ and 400 mJ/㎠, respectively. Interestingly, down-regulation of Bcl-XL was partially mediated by proteasome-degradation pathway. Taken together, UVB irradiation induced the apoptosis of keratinocytes through activations of caspases and down-regulation of Bcl₂ and Bcl-XL. of Bcl-XL expression was decreased by even low irradiation power and its down-regulation partially mediated by proteasome pathway. These data may suggest insight to understand the apoptosis mechanisms as well as carcinogenesis pathways by UVB in skin.