Manassantin B Sensitizes Cancer Cells to TRAIL-mediated Apoptosis through CHOP-dependent DR5 Up-regulation

Abstract

Manassantin B has recently been found to be a potential anti-cancer therapeutic agent which hinders cancer cells from surviving in a hypoxic environment. In this study, treatment with subtoxic doses of manassantin B in combination with TRAIL-induce apoptosis in human cancer cells, but not in human normal mesangial cells, suggesting that this combined treatment may offer an attractive strategy for safely treating cancer. Silencing of DR5 expression using small interfering RNA (si RNA) attenuated manassantin B plus TRAIL-induced apoptosis. Manassantin B also induce ER-stress related proteins (KDEL and ATF3) and ER extension. Manassantin B treatment increased the levels of CAAT/enhancer binding protein homologous protein (CHOP) and activated a DR5 promoter reporter, but not in CHOP mutated DR5 promoter. Silencing of CHOP expression using siRNA abrogated manassantin B-induced DR5 expression. These results thus indicate that manassantin B induces a CHOP-dependent DR5 up-regulation. Collectively, these data suggest that manassantin B sensitizes cancer cells to TRAIL-induced apoptosis through the DR5 up-regulation, which probably involves the induced expression of CHOP.

Manassantin B는 최근 항암효과를 나타낸다고 알려졌다. 그러나 본 연구에서는 manassantin B 단독에서는 암세포의 세포사멸을 야기 시키지 않으며, death receptor 중 하나인 DR5를 증가시키는 것을 확인하여 manassantin B와 TRAIL 혼용처리에 의한 세포사멸 상승효과를 연구하였다. Manassantin B와 TRAIL을 같이 암세포에 처리해 준 결과 24시간부터 세포사멸이 일어나는 것을 관찰할 수 있었다. 그러나 정상세포에서는 세포사멸이 일어나지 않는 것을 관찰하였다. 세포사멸 과정 중의 분자 생물학적 및 생화학적 특성을 관찰해본 결과 DNA 분절, PARP의 분절 및 caspase 3 활성 증가현상을 보였다. 이런 현상은 caspase 억제제(zVAD-fmk)에 의해 저해되므로 manassantin B와 TRAIL에 유도되는 세포사멸은 caspase 의존적인 기전을 통해 일어남을 알 수 있었다. 세포사멸을 저해하는 유전자인 c-FLIP(s)과 Crm A이 과발현된 신장암 세포에서는 manassantin B와 TRAIL에 의한 세포사멸이 일어나지 않는 것을 관찰하였다. 또한 DR5 si-RNA실험을 통해 manassantin B에 의해 증가된 DR5에 의해 세포사멸이 일어난다는 것을 확인할 수 있었다. Manassantin B에 의한 DR5의 증가기전을 알아보았다. 최근 보고에 의하면 CHOP이 ER-stress에 관련된 세포사멸에 중요한 역할을 한다고도 알려져 있지만 DR5의 promoter에 결합하여 DR5 발현에 직접적으로 영향을 미친다고 보고되었다. 본 연구에서도 CHOP si-RNA 실험과 promoter 활성 실험을 통해 CHOP에 의해 DR-5가 증가된다는 것을 관찰할 수 있었으며, manassantin B를 처리한 후 시간별로 CHOP과 DR5의 발현을 확인해 본 결과 CHOP은 3시간부터 DR5는 6시간부터 증가됨을 관찰하였다. 따라서, 여러 가지 암세포에서 manassantin B는 CHOP-의존적 DR5의 증가를 통해 TRAIL과 상승적으로 세포사멸을 이끌어 낸다는 것을 처음으로 규명하였으며 이러한 결과는 이 물질이 암세포의 예방 및 치료에 이용될 가능성이 있음을 나타낸다.