Indole-3-carbinol과 Genistein에 의한 자궁내막암 세포의 세포자멸사 유도

Abstract

Indole-3-carbinol (I3C)은 겨자과 식물, 브로컬리, 양배추 등에 존재하는 항암효과를 가지는 식물 추출물이며, genistein은 콩에 존재하며 chemopreventive 역할을 하는 항에스트로겐의 기능을 가지고 있다. 그러므로 본 연구자는 자궁내막암이 에스트로겐과 밀접한 연관성을 가지고 있는 것에 착안하여 자궁내막암 세포와 정상 자궁내막세포에 I3C와 genistein을 각각 혹은 동시투여로 세포에 미치는 영향을 분석하여 치료에 유용한지를 알아보고자 하였다. 자궁 내막암 세포주로 Hec 1A와 Ishikawa를 정상 자궁 내막 세포는 T-HESCs 세포주를 사용하였다. I3C와 genistein 각 각 혹은 동시 투여 후 자궁내막암 세포에 대한 세포생존율을 알아보기 위해 MTS 분석을 이용하였고, 세포 주기 회로 및 세포자멸사에 관계하는 단백질의 발현을 보기 위해 Western blot analysis를 시행하였다. 세포주기분석은 유세포분석기를 이용하였으며 세포자멸사를 확인하기 위해 DNA fragmentation 방법을 이용하였다. 자궁내막암 세포에 I3C와 genistein을 농도별로 처리하여 24 시간 후의 결과에서 각 각 투여한 것보다 동시 투여시 증식억제의 증가를 보여 50 μmol/L의 농도에서 90% 이상의 증식억제 효과를 보였다. 그러나 정상 세포주인 T-HESCs 에서는 I3C와 genistein에 의한 성장 억제 효과는 보이지 않았다. 세포 주기분석에서 I3C 단독 투여군에서는 세포 주기의 변화가 없었으며, genistein 투여군에서는 sub G1 주기의 지연이 농도가 증가할수록 증가하였으나, 동시 투여군에서 genistein 단독 투여군보다 sub G1 주기의 지연 증가가 배가 되는 세포자멸사를 관찰하였다. 세포자멸사의 증거인 DNA 분절 검사를 시행하여본 결과 I3C에 의해서는 DNA 분절을 보이지 않았으며, genistein 투여군에서는 50 μmol/L의농도에서 DNA 분절 현상을 관찰하였으나, 동시 투여군에서는 농도가 증가할수록 DNA 분절현상이 증가되는 것을 확인하였다. p53, p21, p27과 FAS 단백은 농도가 증가할수록 발현이 증가하였고 Bcl 2는 감소하였으며, I3C와 genistein의 동시 투여시 비활성 형태의 pro-caspase 3 단백질의 양적 감소와 PARP cleavage의 증가와 더불어 세포자멸사로 유도 되는 것을 알았다. 이상으로 I3C와 genistein의 동시투여가 자궁내막암 세포의 증식억제에 효과가 있으며, 또한 정상 자궁내막 세포에는 영향을 미치지 않았다. 이는 두약물이 세포주기에서 subG1 주기의 지연과 세포주기 및 세포자멸사 관련 유전자들의 발현에 영향을 미침으로써 향후 자궁내막암의 치료 약물의 가능성을 보였다고 생각된다. Indole-3-carbinol (I3C) is a phytochemical that has been documented in numerous epidemiological and preclinical studies to possess preventive properties of mammary cancer. I3C is also considered as a promising agents for the prevention of estrogen-enhanced cancers. Genistein is one of the predominant isoflavones found in soy and it has been shown to cell cycle arrest and apoptosis in a variety of cancer cells. The purpose of this study was to determine whether I3C can enhance the inhibitory effect of genistein on human endomtrial cancer cells. The effects of I3C and genistein on cell proliferation and cell cycle progression were examined in human endometrial cancer cells (Hec 1A and Ishikawa) and normal endometrial cells (T-HESCs). MTS reduction assay was carried out to measure the viability of human endometrial cancer cells (Hec 1A and Ishikawa) and normal endometrial cells (T-HESCs) in response to I3C and/or genistein treatment. Cell cycle analysis for I3C and genistein treated human endometrial cancer cells was done by Fluorescent activated cell sorter analysis. DNA fragmentation analysis was also carried out. The expression of cell cycle regulatory- and apoptosis-related proteins were evaluated by Western blot. Teatment with I3C and genistein induced growth inhibition in a dose-dependent manner. Importantely, co-treatment with 50 μmol/L I3C and 50 μmol/L genisten blocked 90% cell growth. FACS results showed that co-treatment with the I3C and genistein increased the percentage of cells in sub G1 phase. Data of Western blot analysis revealed that co-traetment with I3C and genistein induced the expression of p53, p21,p27, and FAS suggesting that I3C and genistein-induced growth inhibition in uterine endometrial cancer cells was associated with increased p21 and p27 expression in a p53-dependent manner. Activation of caspase-3, down-regulation of Bcl-2 and concomitant increase in PARP cleavage were observed in I3C and genistein-treated cells. These results collectively demonstrate that I3C enhances genistein-mediated human endometrial cancer cell growth inhibition through induced apoptosis. Because of the synergistic effect between I3C and genistein, the potential therapeutic efficacy of them at lower concentrations when used in combination may be warranted.