망막색소상피의 증식과 이동에 miR-124와 RHOG가 미치는 영향

Abstract

The proliferation and migration of retinal pigment epithelial cells plays a major role in the pathology of various retinal diseases such as epiretinal membrane, age-related macular degeneration, diabetic retinopathy, and proliferative vitreoretinopathy. Small GTPase RHO is known to regulate the proliferation and migration of retinal epithelial cells, and among them, RHOG has been reported as a major target gene of microRNA-124 (miR-124). Therefore, miR-124 has the potential to regulate the proliferation and migration of retinal epithelial cells. After transfection of miR-124 into cells, an enzyme immunoassay for WST-8 and BrdU was performed to quantitatively measure cell viability and 5-bromo-2' deoxyuridine (BrdU) binding. After miR-124 was overexpressed in cells, the expression ratio of Ki-67 to the number of nuclear staining was calculated. Wound healing ability and cell migration were analyzed under the action of miR-124 and miR-124 inhibitors, and changes in cytoskeleton were confirmed by observation of filamentous actin through phalloidin staining. After overexpression of miR-124, the cell viability and proliferation of retinal pigment epithelial cells and the ratio of Ki-67 expression/DAPI staining were significantly decreased. Wound healing and cell mobility also exhibited effects on the intracellular inhibitors of miR-124, which also significantly decreased. It could be observed that lamellipodia significantly inhibited the motility that can observe filamentous actin. In the target gene identification assay, miR-124 and luciferase 3' UTR luciferase activity are drastically reduced. Inhibition of RHOG by miR-124 reduces cell viability and proliferation, wound healing, and cell migration. Through the results of this study, it was confirmed that miR-124 is involved in various physiological regulation of retinal pigment epithelial cells.

망막색소상피세포의 증식과 이동은 망막전막, 연령관련황반변성, 당뇨병 성망막병증의 견인막형성 그리고 증식유리체망막병증과 같은 다양한 망막질환의 병리에 주요한 역할을 한다. Small GTPase RHO는 망막상피세포의 증식과 이동을 조절하는 것으로 알려져 있고 이중 RHOG는 microRNA-124 (miR-124)의 주요한 타깃 유전자로서 보고되고 있어 miR-124는 망막상피 세포의 증식과 이동을 조절할 가능성이 있다. MiR-124를 세포 내에 도입한 후 세포 생존능과 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) 결합 정도를 정량적으로 측정하기 위해 WST-8과 BrdU에 대한 효소면역분석법을 시행하였고 miR-124를 세포 내에 과발현한 후 핵 염색수에 대한 Ki-67의 발현 비율을 계산하였다. 상처치유능과 세포 이동을 miR-124와 miR-124 저해제의 작용하에 분석하였고 세포 골격의 변화를 phalloidin 염색을 통한 filamentous 액틴의 관찰을 통해 확인하였다. MiR-124을 과발현한 후 망막색소상피세포의 세포 생존능과 증식, Ki-67발현/DAPI염색 비율은 유의하게 감소하였다. 상처 치유와 세포 이동성 또한 유의하게 감소하였고 miR-124의 세포 내저해제에 의해서는 촉진되는 양상을 보였다. Filamentous 액틴을 관찰하였을 때는 운동성을 나타내는 lamellipodia가 유의하게 형성 저해되는 것을 또한 관찰할 수 있었다. 표적유전자확인분석에서 miR-124와 luciferase 플라스미드의 동시 도입은 RhoG 3' UTR luciferase 활성도를 급격하게 감소시켰다. MiR-124에 의한 RHOG의 억제는 세포생존능과 증식, 상처치유, 세포 이동을 감소시킨다. 본 연구의 결과를 통해 miR-124가 망막색소상피세포의 다양한 생리학적 조절에 관여함을 확인할 수 있었다.