백혈병 세포주에 대한 Mistletoe(Abnoba viscumⓇ) 효과 및 기전 분석

Abstract

항암 치료제로 사용되고 있는 Mistletoe(Abnoba viscumⓇ)는 Viscum album에서 추출된 물질로, lectin들과 viscotoxin들이 Abnoba viscumⓇ의 세포독성, 면역조절 효과를 나타내는 유효 성분으로 알려져 있다. 이에 U937(골수성 백혈병) 세포주에 Abnoba viscumⓇ을 투여한 후 발생하는 세포독성의 변화와 세포자멸사의 기전을 연구하고자 하였다. 세포독성 평가는 MTT assay를 시행하였고 세포자멸사는 Abnoba viscumⓇ 처리시 조절 단백질의 변화와 억제, 그리고 활성 산소종(Reactive Oxygen Species, ROS) 생성여부를 확인하였다. U937 세포주에 대한 LD50은 Adriamycin 1.39 ng/mL, Ara-C 22.24 ng/mL, Abnoba viscumⓇ 1,742.14 ng/mL였고 이 약제들의 농도가 높을수록 약제들에 대한 세포독성은 강하게 나타났다. U937 세포주에 다양한 농도의 Abnoba viscumⓇ 처리시 Abnoba viscumⓇ 처리 농도가 높을수록, 일정한 농도의 Abnoba viscumⓇ 처리시 배양 시간이 길수록 sub-G1기의 세포가 증가되었고 caspase가 Abnoba viscumⓇ 처리 농도와 시간에 따라 발현이 감소되었으나 caspase의 기질인 PLC-γ1의 분절현상이 증가함을 확인하였다. 이러한 실험 중 세포자멸사에 관련된 다양한 조절 단백질 중 Mcl-1 단백질에서만 Abnoba viscumⓇ 처리 농도와 시간에 따라 발현이 감소함을 확인할 수 있었다. Caspase inhibitor인 z-VAD-fmk를 전처리 하였을 때 Abnoba viscumⓇ에 의한 세포사멸이 저해됨과 PLC-γ1 분절현상이 억제됨을 확인하였다. 그러나 Mcl-1 단백질의 발현 변화에 대한 실험이 이뤄지지 않아 Abnoba viscumⓇ의 세포자멸사 기전 중 caspase와 Mcl-1 단백질의 발현 변화의 관련성을 규명하지 못했다. Abnoba viscumⓇ 처리 후 ROS가 생성되었고 anti-oxidant로 전처리 후 Abnoba viscumⓇ에 의한 세포사멸이 억제됨을 확인하였다. 이상의 결과는 Abnoba viscumⓇ이 백혈병 암세포에 대한 세포독성이 있으며, ROS 생성에 의한 caspase 의존적인 세포자멸사임을 제시하여 준다. 그러므로 Abnoba viscumⓇ은 백혈병 환자의 치료 보조제 또는 유지요법제로 이용될 수 있다고 생각되며 앞으로 백혈병 환아에서 Abnoba viscumⓇ 임상 연구와 Mcl-1 단백질에 대한 연구를 통한 기전 규명이 필요할 것으로 생각된다. Mistletoe (Abnoba viscumⓇ) extracted from Viscum album L. have mistletoe lectins and viscotoxins which have been known to have cytotoxic and immunomodulatory effects. This study was performed to evaluate the cytotoxicity and the mechanism of Abnoba viscumⓇ in myeloid leukemic cell line, U937. Cytotoxicity of Abnoba viscumⓇ was measured with MTT assay and the mechanism of apoptosis was investigated with the expressions of pro-/anti-apoptotic controlling proteins and the generation of reactive oxygen species (ROS) with FACS and Western blot. Cytotoxicities of the drugs were dose-dependent, and LD50 values of adriamycin, cytarabine, and Abnoba viscumⓇ were 1.39 ng/mL, 22.24 ng/mL, and 1742.14 ng/mL, respectively. Cells in sub-G1 phase and fragmentations of PLC-γ1, substrate of caspase, showed increased activity with dose- and time-dependent patterns in various concentrations and exposure durations of Abnoba viscumⓇ, while caspase-3 showed decreased activity. Among pro-/anti-apoptotic controlling proteins, there were no changes of expressions, except Mcl-1, which was decreased, with higher concentration and longer duration of Abnoba viscumⓇ exposure. Apoptosis and fragmentation of PLC-γ1 by Abnoba viscumⓇ were inhibited by pre-exposure with caspase inhibitor, z-VAD-fmk. Apoptosis by Abnoba viscumⓇ was inhibited by pre-exposures with anti-oxidants. In conclusion, Abnoba viscumⓇ showed cytotoxicity and caspase-dependent apoptosis by ROS generation in myeloid leukemic cell line U937. The prospective studies for clinical effects and therapeutic mechanism of Abnoba viscumⓇ including the expression of Mcl-1 and whether Abnoba viscumⓇ could be used in leukemic patients as supportive and maintenance therapeutic agents in pediatric leukemic patients seem to be warranted in near future.