Carbamylated LDL Increases ROS and Apoptosis via LOX-1 Mediated Pathway in Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Abstract

Carbamylation is a post-translational modification, pathophysiological consequences of which remain poorly understood. very recently, an alternative and dominant mechanism for cyanate formation and protein carbamylation at sites of atherosclerotic plaque was reported. thus, to investigat the effect and signaling pathway of carbamylated low-density lipoprotein on apoptosis and reactive oxygen species (ROS) generation in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Human LDL was carbamylated, copper-oxidized, and characterized. Immunoblot, real-time PCR, and flow cytometric analyses were performed. intracellular ROS generation was determined. transfection with small interfering RNA (siRNA) was also performed. Treatment of cLDL (20 and 100 μg/mL) for 24 h upregulated lectin-like oxidized LDL receptor (LOX-1) in HUVECs. cLDL also increased ROS generation about 2 fold increase and induced apoptosis 5 about 6 fold increase. Exposure of HUVECs with cLDL (100 μg/mL) attenuated phosphorylation of endothelial nitric oxide synthase and increased phosphorylation of ERK1/2 MAPK. Poly ADP ribose polymerase cleavage and expression of p53 were also increased by cLDL treatment. Treatment of ROS scavenger attenuated Poly ADP ribose polymerase cleavage and p53 expression. Inhibition of LOX-1 by siRNA against LOX-1 reversed both cLDL stimulated ROS generations and apoptosis. These results together suggest that cLDL induces ROS generations as well as apoptosis via LOX-1 mediated pathway in HUVECs and may play a critical role in atherogenesis. 카르바밀화는 변역 후 변형으로, 병리생리학적 결과들로 밖에 이해되지 않는다. 가장 최근에 아테롬성 동맥경화적 플라그의 부분들에서 시안산염의 형성과 단백질의 카르바밀화를 위한 대안이 지배적인 기전으로 보고되었다. 카르바밀화는 요소에서 유래된 시안산에 의해서 유도된다. 시안산은 일반적으로 혈장에서 낮은 농도로 존재하며, 만성 신부전증를 가진 환자에서 특징적으로 높아진다. 따라서 이 연구에서는 인간 제대정맥 내피세포에서 세포자멸사와 활성산소의 세대에서의 카르바밀화된 저밀도 지단백질의 경로와 영향에 대해서 조사하였다. 인간의 혈장에서 저밀도 지단백질을 순수분리하여 구리와 시안산을 이용하여 이를 카르바밀화하여 실험에 사용하였다. 형광현미경법, 실시간 PCR, 세포의 자멸사를 분석 하였고, 세포간의 활성산소를 조사하였다. siRNA를 이용하여 트랜스펙션도 실시하였다. 그 결과 인간 제대정맥 내피세포에서 카르바밀화된 저밀도 지단백질(20과 100 μg/mL)를 24 시간 처리하면 LOX-1의 증가를 조절 할 수 있었다. 또한 활성산소가 증가되고 세포자멸사가 유도되었다. 카르바밀화된 저밀도 지단백질(100 μg/mL)은 인간 제대정맥 내피세포의 노출은 eNOS의 인산화는 약화되고, ERK1/2 MAPK의 인산화가 증가되었다. PARP 분열과 p53의 발현 또한 카르바밀화된 저밀도 지단백질 처리에 의해서 증가되었다. 활성산소 처리는 PARP 분열과 p53의 발현이 약화되었다. 또한 LOX-1에 대항하는 siRNA에 의한 LOX-1의 억제는 카르바밀화된 저밀도 지단백질의 활성산소와 세포자멸사를 자극하여 감소되었다. 이들 결과는 인간 제대정맥 내피세포에서 카르바밀화된 저밀도 지단백질은 활성산소 세대의 유도 뿐만 아니라 세포자멸사를 경유한 LOX-1의 중개경로로 생각되며 동맥경화증에 중요한 역할을 할 것으로 판단된다.