실로스타졸(Cilostazol)이 간세포에서 Sterol Regulatory Element Binding Protein-1c 발현에 미치는 영향

Abstract

지방간의 발생기전에 중요한 역할을 하는 sterol regulatory element binding protein-1c (SREBP-1c)의 발현은 인슐린과 liver X receptor (LXR)의 활성에 의해 증가하고 반대로 세포내 cAMP 농도의 증가와 protein kinase A (PKA)의 활성화에 의해 억제된다. 항혈소판 제제로 널리 사용되고 있는 약제인 실로스타졸은 선택적으로 phosphodiesterase type 3를 억제하여 세포내 cAMP의 농도와 PKA의 활성을 증가시켜 항동맥경화효과를 나타낸다. 그러나 현재까지 실로스타졸에 의한 cAMP의 증가가 간세포에서 지방합성에 어떠한 효과를 미치는지에 대해서는 연구된 바가 없다. 따라서 본 연구는 실로스타졸이 간세포에서 SREBP-1c의 발현을 억제하는지를 알아보았다. 간세포로 쥐의 간암 세포주인 H4IIE 세포와 인간 간암세포주인 HepG2 세포를 사용하였다. SREBP-1c 발현을 촉진 시키기 위해 인슐린과 LXR 리간드인 TO901317을 사용하였다. 노던 블롯과 웨스턴 블롯을 통해 SREBP-1c와 fatty acid synthase (FAS)의 mRNA와 단백질의 발현정도를 측정하였다. Transient transfection study를 통해 SREBP-1c 전사촉진자(promoter)의 활성도를 평가하였으며, 겔지연 분석법을 통해 LXR-DNA 결합능력을 측정하였다. 실로스타졸이 SREBP-1c 발현에 영향을 미치는 기전을 알아보기 위해 PKA와 AMP-activated protein kinase (AMPK)의 역할을 알아보았다. 인슐린과 TO901317에 의해 증가된 SREBP-1c mRNA와 단백질 발현은 실로스타졸 투여 후 용량 의존적으로 감소하였으며, FAS mRNA 발현 역시 용량 의존적으로 감소하였다. 실로스타졸은 인슐린과 TO901317에 의해 증가된 SREBP-1c의 전사촉진자 활성을 용량 의존적으로 억제하였다. TO901317에 의해 증가된 LXR-DNA binding activity는 실로스타졸에 의해 용량 의존적으로 감소되었다. TO901317에 의해 증가된 SREBP-1c mRNA가 실로스타졸에 의해 감소되었으나 PKA 억제제인 H-89에 의해 다시 증가되지 않았다. 그러나 실로스타졸은 인슐린이 처리된 H4IIE 세포에서 AMPK 인산화를 용량 의존적으로 증가시켰다. 본 실험을 통해서 실로스타졸이 간세포에서 SREBP-1c의 발현을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였고, 그 억제기전에 AMPK 인산화가 관련있을 것으로 보인다. 향후 동물실험을 통해 실로스타졸이 간 내 지방축적을 억제하는지에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.

Sterol regulatory element binding protein-1c (SREBP-1c) is a key regulator of fatty acid synthesis. Its expression is regulated positively by insulin and liver X receptor (LXR) and negatively by intracellular cyclic AMP and protein kinase A (PKA). Cilostazol is a selective inhibitor of phosphodiesterase 3 and accordingly it increases intracellular cAMP and activates PKA, resulting in anti-platelet aggregation and peripheral vasodilation. This study was designed to evaluate whether cilostazol inhibits SREBP-1c expression in hepatocytes. We investigated the effects of cilostazol on SREBP-1c mRNA and protein expression and fatty acid synthase (FAS) mRNA expression in a rat hematoma cell line (H4IIE) and a human hepatoma cell line (HepG2 cells) using Northern and Western blot analysis. We used insulin and LXR ligand (TO901317) to upregulate SREBP-1c expression and evaluated the effect of cilostazol on SREBP-1c promoter activity by transient transfection study. To discern the mechanism by which cilostazol inhibits SREBP-1c expression, we examined the role of AMP-activated protein kinase (AMPK) and PKA. Insulin and TO901317 dose-dependently increased the expression of SREBP-1c mRNA and protein in H4IIE cells. Pretreatment with cilostazol inhibited the insulin- and TO901317-stimulated SREBP-1c expression in a dose-dependent manner. Cilostazol also inhibited insulin- and TO901317-stimulated activation of the SREBP-1c promoter activity, indicating that cilostazol inhibited SREBP-1c expression at the transcriptional level. Cilostazol's regulation of TO901317- stimulated SREBP-1c mRNA was not reversed by PKA inhibitor (H-89), but cilostazol dose-dependently increased AMPK phosphorylation in insulin-treated H4IIE cells. The present study suggests that cilostazol has an inhibitory effect on insulin- and TO901317-stimulated SREBP-1c expression and cilostazol-induced suppression of SREBP-1c expression has some relevance to AMPK activation. Therefore, further studies on the effects of cilostazol on hepatic steatosis in an animal model need to be performed.