Induction of Apoptosis and Growth Inhibition Using Adenine Nucleotide Translocator 2 Antisense in Uterine Leiomyoma Cells

Abstract

Uterine leiomyomas are the most common benign tumors that arise from smooth muscle cells of uterine myometrium. They occur in approximately 20% to 30% of women older than 30 years of age. This study was designed to find the cause of uterine leiomyoma and to discover a new therapeutic target gene through genetic analysis. Gene Fishing differentially expressed gene (DEG) discovery service was performed to find the difference between gene expression in uterine leiomyoma and normal myometrium. As a result, adenine nucleotide translocator -2 (ANT-2) gene was found. Cell proliferation assay, cell cycle analysis, DNA fragmentation assay, western blotting, and ATP assay were performed to find the effect of ANT-2 siRNA in uterine leiomyoma cells. Treatment with ANT-2 siRNA in uterine leiomyoma cells inhibited cell growth and increased the number of cells in sub G1 phase. The intracellur ATP was reduced in uterine leiomyoma cells by treatment with ANT-2 siRNA. Apoptosis induced by ANT-2 siRNA was confirmed through DNA laddering, annexin V and 4,6-diamidino -2-phenylindole stain. These data indicated that ANT-2 siRNA induced cell apoptosis in uterine leiomyoma cells. Western blot analysis showed ANT-2 siRNA induced an increase in Bax protein levels and decrease in Bcl-2, Bcl- XL protein levels. ANT-2 siRNA induces apoptosis via Bcl-2 mediated apoptotic pathway. Taken together, these results suggest ANT-2 can be a novel target for the development of uterine leiomyoma treatment strategy. 자궁근종은 여성에게서 가장 흔하게 발생하는 양성질환으로 가임여성의 20%, 40대 이상 여성의 40-50%에서 발견된다. 자궁근종의 원인규명과 효과적인 치료를 위하여 정상 자궁근육조직과 자궁근종조직을 대상으로 Gene Fishing differentially expressed gene (DEG) Discovery service를 시행하여, 가능성 있는 유전자를 탐색하고 그 유전자의 기능을 분석하였다. Gene Fishing DEG Discovery Service를 통하여 정상 자궁근육조직과 자궁 근종조직의 유전자 발현 차이를 조사한 결과 Adenine Nucleotide Translocator-2 (ANT-2)유전자가 두 조직에서 발현의 차이가 있음을 발견하였다. ANT-2는 증식중인 세포에서 많이 발현되고 당대사와 세포 분화를 저해하여 암화를 유도하며, 특히 인간세포에서 ANT-2를 억제시켰을 때 세포 성장억제와 세포 자멸사를 유도하는 것으로 알려져 있다. 일차 배양된 자궁근종세포에 ANT-2 siRNA를 transfection하여 ANT-2 발현억제성 세포 생존 및 증식, 세포자멸사 및 세포내에서의 ATP양의 변화를 관찰하였다. 자궁근종세포에서 ANT-2 siRNA를 전달시켜 세포의 생존율이 의미있게 감소되고 FACS analysis에서 sub G1 phase의 세포수가 증가됨을 관찰하여 세포자멸사가 유도됨을 확인하였다. 또한 초기 세포자멸사를 확인하는 annexin V assay에서 대조군에 비해서 apoptotic body가 증가하고 핵 내에서의 DNA의 분절을 확인하였다. Western blot에서 세포자멸사와 관련있는 Bcl-2, Bcl-XL의 감소와 Bax의 증가가 농도 비례적으로 나타났다. 이상의 결과는 자궁근종세포에 ANT-2 유전자를 억제시키면 미토콘드리아에서 생성된 에너지가 세포 밖으로 전달되지 못하여 세포의 증식이 억제되고 세포자멸사를 유도한다는 것을 나타내며, ANT-2 유전자 차단이 자궁근종 유전자 치료법이 될 수 있음을 의미한다.