혈관 석회화를 제어하기 위한 Dimethyl Fumarate의 효능 평가

Abstract

당뇨병 및 만성신부전환자는 혈관 석회화가 증가된다는 보고가 있으며 대동맥 석회화는 대동맥 벽의 탄성을 감소시키고 관상동맥 혈류공급에 장애를 초래하여 심근경색 및 심부전의 위험을 증가시킨다고 알려져 있다. Dimethyl fumarate (DMF)는 항암제의 보조물질로 알려져 있으며 동맥경화증에서 혈관 평활근세포(VSMC)의 증식을 억제하는 것으로 연구되고 있다. 이에 본 연구는 동맥경화증의 치료제로 연구되고 있는 DMF가 혈관 석회화에 미치는 영향을 조사하고자 실시되었다. 혈관 평활근세포에서 무기 인산(Pi)을 이용하여 석회화를 유도하고 DMF를 처리한 후 영향을 확인한 결과, 혈관 석회화가 DMF의 농도-, 시간-의존적으로 감소하는 것을 칼슘 침착량과 Von Kossa's 염색법을 통해 확인하였다. 석회화가 유도된 혈관 평활근세포에서 혈관 석회화와 뼈, 연골 형성을 조절한다고 알려진 유전자의 발현을 Luciferase reporter assay, RT-PCR을 통해 분석한 결과 DMF에 의해 RUNX2, Osteocalcin, ALP, BMP2의 발현이 감소됨을 확인하였다. DMF는 Nrf-2의 활성을 증가시킨다고 알려져 있는데 실험을 통해 Nrf-2의 안정화를 증가 시킨다는 것을 RT-PCR, Western blot을 통해 확인하였다. 그래서 Nrf-2의 조절로 인해 무기인산으로 유도된 혈관 석회화 기전을 억제할 수 있는지를 알아보았다. Nrf-2의 처리와 골 형성 관련 유전자인 BMP-2 활성을 확인한 결과 Nrf-2는 DMF와 마찬가지로 BMP-2 프로모터의 활성에는 관여하지 않지만 BMP-2의 활성을 감소하는 것을 확인하였다. 따라서 DMF가 BMP-2 signaling pathway를 억제함으로써 혈관 석회화를 감소시키는데 중요하게 작용한다는 것을 확인하였다. 혈관 석회화 동물모델에서 DMF의 효과를 관찰한 결과, C57BL/6 마우스에 고농도의 Vitamin D3를 투여하여 유도된 혈관 석회화가 경구 투여된 DMF의 용량에 의존적으로 감소되는 것을 칼슘 침착량의 측정과 전체 대동맥의 von Kossa's 염색을 통해 확인하였다. 이러한 연구 결과, DMF가 Nrf-2의 증가와 BMP-2 signaling pathway의 제어를 통해 혈관 석회화를 억제시키는 분자적인 기전을 제안하였고 앞으로 DMF가 혈관 석회화의 치료제로서의 효과를 나타낼 것으로 생각되며 혈관 석회화 기전 연구에 중요한 단서를 제공할 것으로 사료된다.

Vascular calcification (VC) is prevalent in patients with chronic kidney disease (CKD) as Well as atherosclerosis, aging and diabetes. Aortic calcification significantly increases the risk of cardiovascular morbidity and mortality by promoting arterial wall stiffness and a progressive decline of compliance of the blood vessels. Dimethyl fumarate (DMF) has been used to treat psoriasis and induces the antioxidant transcription factor Nrf-2 pathway and subsequent antioxidative and phase II detoxifying enzyme. This study was undertaken to examine the effect of DMF, an anti-atherogenic agent on VC. VSMC calcification was induced by inorganic phosphate (Pi) and DMF significantly diminished the Pi-induced calcification in a time and dose dependent manner, as demonstrated by decreased calcium deposition visualized by von Kossa's staining and determined by measurement of calcium contents. Transient transfection assay showed that DMF repressed several osteogenic gene promoters including Runx2, osteocalcin, alkaline phosphatase (ALP), and bone morphogenic protein-2 (BMP-2). DMF increased protein levels and nuclear localization of Nrf-2, whereas it did not change mRNA level of Nrf-2, suggesting that DMF stabilized Nrf-2 at the posttranslational levels but not transcriptional levels. Moreover, Nrf-2 repressed both BMP-2 gene promoter and BMP-2-stimulated BRE activity, suggesting that Nrf-2 directly inhibits downstream signaling pathway of BMP-2. finally, using an animal model of calcification induced by excessive dose of vitamin D3, we demonstrated that DMF significantly reduced vitamin D3-induced calcification of whole aorta. Taken together, these results suggest that DMF inhibits VC through Nrf-2-dependent repression of BMP-2 expression and its downstream signaling pathway, leading to suppression of several osteogenic genes. This study also provides a molecular basis of potential use of DMF as a therapeutic agent for the prevention and treatment of VC.