Enhanced Expression of Transcription Factor Nrf2 by Isoliquiritigenin in Uterine Leiomyoma Cells

Abstract

ISL, a calchone flavonoid, has cancer-preventing properties and is often used in Chinese medicine. It has been previously demonstrated that ISL induces growth inhibition in human uterine leiomyoma cells mediated by caspase-dependent pathway and death receptor. Inhibition of cell proliferation by ISL had little effect on normal cells compared to leiomyoma cells. The objective of the present study was to evaluate the unknown cellular and biochemical responses to ISL treatment in uterine leiomyoma cells and normal myometrial cells. Microarray analysis revealed that ISL induced expression of several genes related with antioxidative activities including vitagen (Heat shock protein 70), tumor necrosis factor ligand (TNF), activity-regulated cytoskeleton-associated protein (ARC), growth arrest and DNA-damage-inducible, beta (GADD45B). Many of genes which known as involved in cellular defense system against damage induced by ROS were present in the list of up-regulated genes by ISL. Treatment with ISL decreased expression of intracellular ROS level, in a dose related manner. In order to evaluate the relationship between ISL and ROS, the expression of the antioxidant enzyme HO-1 was analyzed. ISL induced a increase in HO-1 protein levels in dose dependent manner. Western bolt analysis of nuclear fraction showed a gradual increase in Nrf2 levels in a dose dependent manner. The translocation of Nrf2 protein into nucleus following ISL treatment was associated with a marked increase in HO-1 expression. Fluorescence microscopy revealed that ISL induced the nuclear localization of Nrf2 in uterine leiomyoma cells. This data indicated that Nrf2 was mobilized from cytosol to the nucleus by ISL. These results suggest that ISL enhance nuclear translocation of transcription factor Nrf2 with induction of some Phase II enzymes and antioxidant-responsive genes in uterine leiomyoma cells. This phenomenon has not been previously reported for ISL. In conclusion, the presented data suggest the role of Nrf2 in ISL-induced growth inhibition in uterine leiomyoma cells. Isoliquiritigenin (ISL)은 감초, 콩 등에 존재하는 항암, 항 염증효과를 가지는 식물 추출물이다. 본 연구자는 자궁근종세포에 ISL을 투여하여 세포주기 지연과 death receptor를 통하여 세포자멸사가 일어남을 보고하였다. 특히 50 μM의 ISL을 처리하였을 때 정상자궁근 세포는 거의 영향을 받지 않는 반면, 자궁근종은 70%정도의 세포자멸사를 보였다. 이에 본 연구자는 ISL이 또 다른 기전을 통해 세포자멸사 또는 증식억제에 관계한다고 가정하고 연구를 계획하였다. 자궁근종으로 수술 받은 3예의 환자에서 자궁근종과 정상 자궁근 세포를 일차 배양하여 ISL 50 μM을 각각 투여하여, 자궁근종 세포와 정상자궁근 세포의 유전자 발현 차이를 보기위해 DNA microarray를 이용하였다. 그 결과 공통적으로 자궁근종세포에서 2배 이상 증가된 유전자는 항산화적 스트레스 반응과 관계있는 activity-regulated cytoskeleton-associated protein (ARC), tumor necrosis factor (TNF), matrix metallopeptidase (MMP), heat shock 70kDa protein (HSP70B), growth arrest and DNA-damage-inducible, beta (GADD45B)이었다. ISL이 산화적 스트레스를 감소시키는 것을 확인하기 위해 reactive oxygen species (ROS)를 세포주기분석기로 분석하여, ISL을 처리한 자궁근종세포의 ROS가 감소하는 것을 확인하였다. 산화적 반응과 관련된 유전자중 하나인 heme oxygenase-1 (HO-1)의 변화를 Western blot으로 측정하여 ISL에 대해 농도 의존적으로 발현이 증가 되는 것을 확인하였다. 그리고 HO-1의 중요한 핵내 전사인자인 Nrf2의 발현은 ISL 투여에 의해 세포질에서 핵내로의 이동을 확인하였고, 면역형광현미경으로도 핵내로의 이동이 ISL 농도 의존적으로 진행되는 것을 확인하였다. 이상으로 ISL이 자궁근종세포에서 성장억제 및 세포자멸사를 유도할 때 산화적 스트레스 반응을 감소시키고, HO-1 단백의 발현을 활성화시키고, 나아가서는 핵내 전사인자인 Nrf2의 핵내 활성을 증가시키는 것을 확인하였다. 그러므로 자궁근종 세포에 대한 ISL의 작용기전은 세포주기의 지연, death receptor 뿐 아니라 산화적 스트레스 반응을 감소시키는 핵내 전사인자인 Nrf2의 발현을 유도하여 성장억제에 관여함을 알았다.