Bleomycin에 의해 유도된 경화성 동물 모델에서 AP-1 Decoy ODN의 항섬유화 유전자 치료 효과

Abstract

경피증은 활성화된 섬유모세포에서 교원질의 합성이 증가되어 진피 내에 과도한 교원질의 축적을 특징으로 하는 결합 조직 질환으로 그 정확한 발병 기전과 치료 방법의 규명을 위한 연구들이 현재까지도 활발히 진행 중이다. 현재 많은 질환들이 발생 기전과 치료 방법의 연구에 특정한 동물 모델들을 이용하고 있으며, 경피증의 경우도 ‘tight skin mouse’, ‘UCD 200 chicken’, ‘Graft-versus-host disease mouse’, ‘New Zealand rabbit’과 같은 동물 모델들이 이용되어 왔으나, 이들은 비용이 많이 들고, 발병 기전이 경피증과 많이 달라서 널리 이용되지는 못하였다. 따라서, 최근에 보고되고 있는 bleomycin을 이용한 경화성 동물 모델은 제작이 간편하고, 발생 기전이 경피증과 아주 유사하여, 이전 동물 모델들에 비해서 경피증의 연구에 매우 유용할 것으로 생각된다. Bleomycin이 섬유화를 유발시키는 가장 주된 발병 기전은 TGF-β의 활성화로 인한 제 1형 교원질 발현의 증가로 추정되며, 경피증의 경우도 이와 유사한 작용 기전을 가질 것으로 보인다. 따라서, TGF-β의 활성화를 유전자 수준에서 차단시킨다면 경피증 뿐만 아니라 인체 내 다양한 병적 섬유화 과정들을 효과적으로 억제시킬 수 있을 것으로 생각된다. AP-1 decoy ODN은 DNA의 AP-1 촉진자 결합 부위에 AP-1와 경쟁적으로 결합하여 AP-1의 작용을 차단할 목적으로 개발된 합성 유전자로, 현재까지 AP-1 decoy ODN의 항섬유화 효과를 동물 모델을 통해서 증명한 연구는 없었다. 따라서, 이 연구에서는 bleomycin으로 경화성 동물 모델을 재현하고, AP-1 decoy ODN의 항섬유화 유전자 치료 효과를 유도된 동물 모델에서 확인하기 위하여, 무모 생쥐의 피부에 bleomycin을 0.3, 1.5, 3.0 mg/ml 의 농도로 주입한 경우와 3.0 mg/ml의 bleomycin과 AP-1 ODN decoy를 동시에 주입한 경우에서 제 1형 교원질과 TGF-β의 발현 정도를 각각 분석하였다. 제 1형 교원질의 발현 정도는 Hematoxylin-eosin 염색, Masson trichrome 염색, dot blot, Western blot 분석을 통해서 확인하였으며, TGF-β의 발현은 면역조직화학염색을 통해서 확인하였다. 그 결과, bleomycin의 농도가 증가함에 따라 제 1형 교원질과 TGF-β의 발현은 증가하였으며, bleomycin으로 유도된 교원질과 TGF-β의 발현은 AP-1 decoy ODN 유전자의 주입을 통하여 감소하였다. 결론적으로 무모 생쥐에서 bleomycin의 국소 주입으로 인해 유도되는 진피 내 섬유화 현상을 AP-1 decoy ODN 유전자가 차단하는 효과는 향후 경화성 피부 질환의 유전자 치료에 중요한 기초 자료가 될 수 있을 것으로 생각된다. Scleroderma is a connective tissue disorder characterized by excessive collagen production by activated fibroblasts. Although numerous studies have been elucidate the pathogenesis of scleroderma, the effective therapeutic strategies have been under investigated for improving the sclerosis of the skin. The purpose of this study is the establishment of a mouse model for scleroderma and confirmation the anti-fibrotic effect of AP-l decoy ODN in vivo study. Dermal sclerosis was induced by intradermal injection of bleomycin at a dose of 0.3, 1,5, 3 (mg/ml) into back skin of BALB/C mice twice a week for 4 weeks. To confirm anti-fibrotic effect of AP1-decoy ODN, the AP-1 decoy ODN was transfected into subcutaneous tissue of mice with or without bleomycin. Dermal sclerosis was examined by Hematoxylin-eosin (H & E) staining and Masson trichrome staining. Histopathological examination revealed that the dermal sclerosis with the deposition of thickened and homogenous collagen bundles was increased according to concentration of bleomycin. The expressions of type I collagen and TGF-β1 were markedly increased in bleomyin-injected mice. Furthermore transfection of AP-1 decoy ODN with bleomycin suppressed the dermal sclerosis and type I collagen gene expression as well as TGF-β1 in mice. AP-1 decoy ODN inhibits the bleomycin-induced dermal sclerosis through down-regulation of type I collagen and TGF-β1 expression in BALB/C mice. Thus the anti-fibrotic effect of AP-1 decoy ODN in bleomycin-induced sclerotic mouse model suggests the fundamental data for gene therapy of scleroderma.