HaCaT 각질형성세포에서 TNF-α에 의한 Human β-defensin-2 발현 증가

Abstract

피부 면역반응에는 피부에 존재하는 여러 세포들과 국소 림프절이 관여하고, 이외에도 내인성 항균 펩티드가 피부에서 세균의 침범 시 면역반응의 중요한 요소로 작용한다. Human β-defensin-2 (hBD-2)는 미생물이나 염증 반응에 의해 상피세포에서 생성되는 항균 펩티드로 세포매개성 면역반응을 증강시키고, 표피세포와 섬유아세포에 대한 증식 및 분화 과정에 영향을 미쳐 창상치유를 촉진하는 기능도 있다. 피부질환 발병에 중요한 사이토카인인, TNF-α로 각질형성세포에 자극을 주면 hBD-2의 발현이 증가되어, 항균작용을 하게 되는데, 그러나 그 발현 양상 및 조절기전에 대한 연구는 드물다. 이 연구는 HaCaT 세포에서 hBD-2의 발현 양상 및 조절 기전에 대해 연구함으로써 만성 피부 질환에 있어 세균감염 방어 기전을 이해하고자, TNF-α를 HaCaT 세포에 처치하고, hBD-2의 발현 양상을 면역형광염색 및 reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR)을 통해 평가하였고, NF-κB의 발현 양상은 Western blot법 및 EMSA 실험으로 확인하였다. 그 결과 면역형광염색상 TNF-α처치한 HaCaT 세포에서 hBD-2 단백의 발현이 강하게 나타났으며, RT-PCR 분석 상 HaCaT 세포에서 TNF-α의 농도 및 시간이 증가함에 따라 hBD-2 mRNA 유전자의 발현이 증가하였다. Western blot법 및 EMSA 실험 상 TNF-α 처치 시 NF-κB가 활성화되었으며, NF-κB 억제제 처치 시 hBD-2 mRNA 유전자의 발현은 감소되었다. 뿐만 아니라 RT-PCR 분석 상 p38 MAPKs 억제제 처치 시에도 hBD-2 mRNA 유전자의 발현이 다소 감소되어, TNF-α에 의한 hBD-2 발현 증가 시 NF-κB 및 p38 MAPKs 신호 전달 체계가 관여함을 관찰하였다. 이상의 결과는 HaCaT 세포에서 TNF-α의 자극에 의해 hBD-2의 발현이 증가되며, 이 과정은 NF-κB 혹은 p38 MAPKs 기전이 활성화되어 일어남을 시사하고, 이는 hBD-2 유전자 발현에 의한 정상 피부 및 피부 질환의 세균 감염 방어기전 연구에 기초 자료가 될 것으로 생각된다.

Several kinds of epithelial cells and focal lymph nodes are known to be involved in skin immune reaction. Especially, internal antimicrobial peptide play an important role to protect microbial agents. Human β-defensin-2 (hBD-2) is an antimicrobial peptide that is produced by epithelial cells after stimulation with microorganisms or inflammatory mediators. hBD-2 participates in the increase of the cell-mediated immune reaction. And it also affects proliferation and differentiation of epithelial cells and fibroblasts, resulting in enhancement of wound healing. However, it is little known whether the TNF-α induces the expression of hBD-2 in HaCaT cells through the NF-κB or MAPKs pathways. The purpose of this study is to investigate roles of NF-κB and MAPKs transcription factors in the molecular pathway of TNF-α-induced hBD-2 expression in HaCaT cell lines. In this study, the expression of hBD-2 in TNF-α-treated HaCaT cells was analyzed by immunofluorescence staining and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). The expression of NF-κB was analyzed by Western blot analysis and electrophoretic mobility shift assay (EMSA). In the result, strong positive hBD-2 immunofluorescence staining in TNF-α-treated HaCaT cells was observed. According to RT-PCR analysis, the expression of hBD-2 was increased in TNF-α-treated HaCaT cells by dose-dependent and time-dependent manners. In addition, according to Western blot analysis and EMSA, NF-κB was also activated in TNF-α-treated HaCaT cells. Interestingly, the expression of hBD-2 in TNF-α-treated HaCaT cells was attenuated in the presence of NF-κB inhibitors, PDTC or MG132. Furthermore, MAPKs inhibitors, especially SB (p38 inhibitor), partially attenuated the TNF-α-induced hBD-2 expession, but not PD (ERK inhibitor) and SP (JNK inhibitor). These results collectively suggest that hBD-2 is up-regulated in TNF-α-treated HaCaT cells through activation of NF-κB and p38 MAPKs pathway. Our data regarding the up-regulation of hBD-2 may help us to understand the antimicrobial mechanism in normal skin or other skin diseases.