시안산에 의한 조골세포의 손상에서 아미노산과 알부민의 효과

Abstract

신성 골이영양증은 말기 신부전 환자의 이병율을 증가시키고 삶의 질을 떨어뜨리는 중요한 원인으로, 부갑상선 호르몬과 비타민 D 의 조절 장애가 주요 병인기전으로 알려져 왔으며, 조골세포에 대한 요독의 억제 작용도 관여하는 것으로 알려져 있다. 이러한 요독 중 시안산은 요소로부터 전환되어 생성되며 신장 기능이 감소함에 따라 요소의 증가와 함께 증가하는데, 특히 조골세포에서 세포자멸사를 유발하는 것으로 알려져 있다. 이 연구에서는 시안산이 음전하를 가지고 있음으로, 아미노 군을 가진 아미노산 및 각종 약물 및 독소들과 결합 능력을 가진 알부민 등의 일부 단백질을 이용하여 시안산에 의한 조골세포 손상을 방지할 수 있는지를 알아보고자 하였으며 이를 통해 신성 골이영양증을 방지하는 방법을 제시하고자 하였다. 골육종 세포주인 ROS 17/2.8 세포를 사용하여 시안산을 0-40 mmol/L 가한 후 MTT 측정법으로 세포에 대한 독성을 측정하였다. 아미노산은 0.1-10 mmol/L가 되도록 가하여 시안산에 의한 세포 독성 감소 효과를 관찰하였으며, 알부민 및 각종 단백질들은 50 mg/mL의 농도가 되도록 첨가하여 그 결과를 관찰 하였다. 또한 아미노산과 알부민을 비롯한 각종 단백질의 카르바밀화 정도는 TNBS 반응으로 자유 아미노기의 양을 측정하여 계산하였다. 연구 결과 20 종의 아미노산은 50% 내외의 자유기 소실을 나타내었으나 각 아미노산 별 자유기 소실 정도 아미노산 특성에 따른 차이를 나타내지 않았다. 단백질 중에서 알부민은 약 20%의 자유기 소실을 나타내었으나 혈색소와 면역 글로불린은 자유기 소실을 나타내지 않았다. 또한 특히 알부민 순수 정제 액에 시안산을 넣고 알부민 자신이 카르바밀화되는 정도를 관찰하였을 때 알부민의 농도에 따라, 시안산과의 배양 시간에 따라 증가되는 양상을 나타내었다. 세포 생존율에 미치는 실험에서 Asp, Glu, Leu, Trp 및 Tyr이 시안산에 의한 조골세포의 생존율의 감소를 유의하게 방지하였다. 또한 단백질 중에서는 알부민만이 시안산에 의한 조골세포 생존율 감소를 방지하였다. 이상의 실험 결과로부터 Asp, Glu, Leu, Trp, Tyr 및 알부민이 시안산과 반응하여 자신이 카르바밀화 됨으로써 시안산 의한 조골세포 생존율 감소를 방지하는 것으로 생각되며, 말기 신부전 환자에서는 체내 증가된 시안산이 조골세포의 세포자멸사를 유발하여 신성 골이영양증과 같은 골질환을 초래할 때 이들 물질의 적절한 보충은 신부전 환자의 골질환을 방지하는데 도움이 될 것으로 생각된다. Cyanate, which is known as one of the uremic toxins and is derived spontaneously from urea at body temperature and pH, has several effect on the biologic substances include erythropoietin, antioxidant and ceruloplasmin. To find out the protective materials from the hazardous effect of cyanate in osteoblast, we added twenty amino acids, albumin globulin and hemoglobin in the culture media containing osteoblastic cells with cyanate. Osteoblastic ROS 17/2.8 cells, exposed to various concentrations of sodium cyanate, were used to analyze for the cytotoxicity. The cyanate-induced cytotoxicity was assessed by the MTT assay by measuring the absorbance of the reaction solution at 570 nm. Viability of the treated cells was expressed as A570 of sample/A570 of control. The degree of the carbamylation was measured using trinitrobenzenesulphonic acid. The degree of the carbamylation in amino acid was about 50% in average. The degree of the carbamylation in albumin was increased depend on the incubation time with cyanate, and increased depend on the concentration of the cyanate. The degree of the carbamylation in globulin and hemoglobin was nearly zero. Asp, Glu, Leu, Trp and Tyr among the twenty amino acids revealed the protective effect against the damage induced by cyanate. And only albumin among the three proteins revealed the protective effect. On the basis of these results, Asp, Glu, Leu, Trp, Tyr and albumin are useful tools for the protection against damages by cyanate carbamylation in end-stage renal disease patients with renal osteodystrophy.