Chondroitin-sulfate를 결합한 I형 콜라겐지지체와 연골세포를 이용한 연골재생

Abstract

송아지의 진피에서 추출한 atelo-collagen으로 제작한 직경 6 mm, 두께 2 mm의 물리적 가교만 처리한 type I collagen scaffold (Collagen-DHT) (1군)와 물리적 가교에 화학적 가교처리를 추가한 type I collagen scaffold (Collagen-EDC) (2군), chondroitin sulfate(CS)를 결합 시켜서 물리적 가교처리한 type I collagen scaffold (CS-Collagen-DHT) (3군)와 CS를 공유결합 시킨 물리적 가교에 화학적 가교를 추가한 type I collagen scaffold (CS-Collagen-EDC) (4군) 그리고 토끼의 귀에서 채취해서 배양한 연골세포(chondrocyte, Chondro)를 2 x 105개/20 µL를 위의 각각의 군에 파종한 Chondro-Collagen-DHT (5군), Chondro-Collagen-EDC (6군), Chondro-CS-Collagen-DHT (7군), Chondro-CS-Collagen-EDC (8군)를 토끼 귀에서 연골막이 남아있는 연골결손부에 이식하였다. 이식 4, 8, 그리고 12주에 조직을 생검하여 H&E와 alcian blue로 염색하여 현미경 하에서 연골생성 정도를 정량적으로 분석하고 역전사중합반응으로 type I 과 type II collagen의 mRNA발현 정도를 내부유전자 GAPDH와 상대적으로 분석하였다. 연골세포를 파종하지 않은 1, 2, 3, 그리고 4군에서 술 후 4주에 연골이 조금씩 생성되기 시작하였는데, 1군에서 조금 우수하였다. 술 후 8주에 3군에서 연골생성이 중앙부위까지 도달하였고, 골화가 2군에서 가장 많았다. 12주에 3군에서 연골생성이 가장 많았고, 4군에서 지지체가 아직 많이 남아 있었다. 연골세포를 접종한 5, 6, 7, 그리고 8군에서 술 후 4주에 모든 군에서 가장자리에서부터 연골이 생성되기 시작하였는데, 7군과 8군에서 조금 우수하였고, 전반적으로 연골세포를 접종하지 않은 1, 2, 3, 그리고 4군보다는 연골이 많이 생성되었다. 5, 6, 그리고 7군에서 4주에 골화가 관찰되었다. 술 후 8주와 12주에 6군과 8군에서 연골생성이 많았고, 12주에 6군과 8군에서 아직도 지지체가 남아 있었는데, 8군에서 가장 잘 관찰할 수 있었다. 연골세포를 파종하지 않은 1, 2, 3, 그리고 4군에서 내부대조유전자인 GAPDH를 기준으로 한 type I collagen의 mRNA발현은 시간이 경과함에 따라 감소하였다. 그러나 type II collagen의 경우 시간이 지날수록 중가 하였는데, 3군과 4군 즉, CS를 결합한 지지체에서는 8주에 가장 많이 증가하였다가 12주에 다소 감소하였다. 연골세포를 파종한 5, 6, 7, 그리고 8군에서는 type I collagen의 mRNA발현은 시간이 경과함에 따라 발현되는 양이 전체적으로 감소하였다. 그러나 type II collagen의 경우 4주에서 8주로 가면서 모든 군에서 증가 하였는데, 12주에는 8군을 제외하고 모두 감소하였다. CS의 추가는 연골생성에 큰 영향을 미치지 않았다. 연골세포를 파종하지 않은 군에서는 물리적 가교처리만 한 군에서 더 많은 연골이 생성되었지만, 연골을 파종한 군에서는 물리적 가교에 화학적 가교처리를 추가한 군에서 연골생성이 많았다. 지지체에 CS와 화학적 가교처리를 추가한 군에서는 12주에도 지지체가 많이 남아있었다. 연골세포를 파종한 군은 파종하지 않은 군보다 더 많은 연골이 생성되었지만, 골화가 더 일찍 시작되었다. 결론적으로, type I atelo-collagen의 가교처리 방법과 연골세포의 접종이 연골생성에 영향을 주며, 연골세포를 추가할 경우 연골생성은 많이 되지만 골화가 빨리 시작하는 단점이 있어, 연골세포의 노화를 방지하는 연구가 앞으로 더 필요할 것으로 생각한다. Collagen is the principal structural biomolecule in cartilage extracellular matrix, which makes it a logical target for cartilage engineering. In this study, porous type I collagen scaffolds were cross-linked using dehydrothermal (DHT) treatment and/or 1-ethyl-3-(3-dimethyl aminopropyl) carbodiimide (EDC), in the presence and absence of chondroitin-6-sulfate (CS) and cultured autologous chondrocytes (Chondro). Cartilage defects were created in the proximal part of the ear of New Zealand rabbits. Eight prepared groups of scaffolds (n=4) were inserted. The groups included Collagen-DHT (Group 1), Collagen-DHT-EDC (Group 2), CS-Collagen-DHT (Group 3), CS-Collagen-DHT-EDC (Group 4), Chondro-Collagen-DHT (Group 5), Chondro-Collagen-DHT-EDC (Group 6), Chondro-CS-Collagen-DHT (Group 7), and Chondro-CS-Collagen-DHT-EDC (Group 8). Histomorphometric analysis and cartilage-specific gene expression of the reconstructed tissues 4, 8, and 12 weeks after implantation were evaluated. In the chondrocyte non-seeding groups, the largest quantity of regenerated cartilage was found in DHT cross-linked groups 1 and 3 at week eight and than decreased at week 12, while increasing calcification. Calcification was observed starting at week eight and the area increased at week 12. Group 4 was treated with EDC cross-linking and CS, and the matrix did not degrade at week 12. Chondrocyte seeding groups showed more cartilage formation than non-seeding groups. EDC cross-linked groups 6 and 8 regenerated more cartilage than other groups. However, calcification was observed at week four after implantation. CS did not increase chondrogenesis in all groups. Cartilage-specific type II collagen mRNA expression increased with time in all groups. In conclusion, EDC cross-linking may prevent chondrocyte infiltration from the perichondrium into the collagen scaffold in chondrocyte non-seeding groups, but maintain the scaffold and promote extracellular matrix production of chondrocytes in chondrocyte seeding groups.