Inhibitory effects of glucosamine on lipopolysaccharide-induced activation in microglial cells

Abstract

This study investigated the effects of glucosamine on lipopolysaccharide (LPS)- induced cellular activation, inducible nitric oxide synthase (iNOS) expression in microglia, and the molecular and signaling mechanisms involved. LPS (100 ng/mL) was used for activation of primary cultured rat microglial or BV2 microglial cells. The changes in intracellular Ca^(2+) level and outward K^(+) currents were measured by using fura-2/AM and whole-cell patch clamp method, respectively. LPS-induced mRNA and protein expressions for iNOS and other signaling factors were analyzed by reverse-transcription polymerase chain reaction and Western blot analysis, respectively. LPS transformed cell morphology into ameboid shape in vitro and induced immunohistochemical activation in vivo, but pretreatment with glucosamine recovered the microglial activations into the control untreated levels. Glucosamine also blocked LPS-induced Ca^(2+) influx, outward K^(+) currents and tumor necrosis factor (TNF)-α mRNA expression which are typically representing for an activation of microglia. Glucosamine attenuated LPS-induced iNOS protein and mRNA expression in dose- and time-dependent manners, but did not affect iNOS protein stability. However, the inhibitory actions of glucosamine on LPS-induced iNOS expressions were independent of nuclear factor-κB signals and mitogen-activated protein kinases activations. Glucosamine inhibited LPS-induced phosphorylation of ribosomal p85 S6 translational regulatory protein which may down-regulate translation in iNOS mRNA. These results suggest that inhibitory action mechanisms of glucosamine on LPS-induced microglial activation include inhibitions of Ca^(2+) influx and outward K^(+) currents as well as down-regulation of microglial activator genes TNF-α and iNOS herein. 이 연구는 신경보호 작용 연구의 일환으로 glucosamine의 미세아교세포 활성 억제 효과를 검증하고 그 작용 기전을 파악하고자 하였다. 실험에 사용한 세포는 흰쥐 태아의 뇌에서 획득한 후 일차 배양한 미세아교세포와 미세아교세포주인 BV2세포 그리고 뇌절편을 이용하였다. 미세아교세포의 강력한 활성 유도 물질 중의 하나인 lipopolysaccharide (LPS, 100 ng/ml)로 활성을 유도하였다. LPS에 의한 미세아교세포의 활성과 이에 대한 glucosamine (10 mmol/L)의 활성 억제 효과를 면역화학적 방법, 세포형태적 변화, fura-2 형광물질을 이용한 세포내 칼슘 농도 측정, whole-cell patch clamp기법에 의한 칼륨전류 측정, 역전사 중합효소연쇄반응과 Western blot 분석을 통한 tumor necrosis factor (TNF)-α 및 inducible nitric oxide synthase (iNOS) 발현 및 신호전달 과정을 분석하였다. Glucosamine은 LPS에 의해 유도된 세포막의 칼슘 유입과 전압의존성 외향성 칼륨전류의 발생을 차단하였다. LPS에 의해 미세아교세포는 뇌절편 및 세포형태상에서 활성화되었고 TNF-α의 발현도 증가되었지만, glucosamine에 의해 대조 수준으로 회복되었다. 또한 glucosamine은 LPS에 의해 증가된 iNOS mRNA 및 단백 발현을 농도 및 시간 의존적으로 감소시켰으며, 그 신호전달 과정 중에서 미세아교세포의 활성에 관여하는 것으로 알려진 mitogen activated protein kinases와 nuclear factor-κB 경로와는 무관한 반면에, ribosomal p85 S6 kinase의 인산화 과정을 억제하여 iNOS 단백 발현을 억제하였다. 이상의 결과로 보아 glucosamine은 LPS에 의한 미세아교세포의 칼슘 유입과 칼륨전류 발생의 차단, TNF-α의 발현 억제 그리고 p85 S6 kinase의 인산화를 억제하여 iNOS 발현을 감소시킴으로써 이 세포의 활성을 억제하는 것으로 생각된다.