혈관평활근세포에서 TNF-α에 의해 증가된 Fractalkine의 발현에 대한 pioglitazone의 억제 효과

Abstract

죽상동맥경화증은 다양한 염증관련인자와 단핵구, 혈관내피세포 및 혈관평활근세포의 상호작용에 의해 일어나는 만성염증성질환이다. 죽상동맥경화증의 병태생리에서 혈관평활근세포의 이주와 증식은 아주 중요하며 이과정은 TNF-α와 같은 염증자극인자에 의해 혈관평활근세포에서 케모카인을 포함하는 염증관련인자의 발현의 증가로 촉진된다. 최근 CX3C 케모카인 군에 속하는 fractalkine이 염증반응에 관여하고 이의 활성은 전사인자 NF-kappa B에 의해 조절됨이 밝혀졌다. 당뇨병 치료제로 널리 사용되고 있는 pioglitazone은 PPAR-γ 항진제로 혈당강하효과 외에 전사인자 NF-kappa B의 활성을 억제하여 동맥경화증에 효과가 있음이 보고되고 있다. 따라서 pioglitazone의 항죽상동맥경화 기전이 전사인자 NF-kappa B의 활성 억제에 따른 fractalkine 발현억제에 의한 것인지를 알아보고자 본 연구를 진행 하였다. 혈관평활근세포는 백서의 대동맥에서 분리, 배양하였고 염증유도 물질로 TNF-α를 사용하였다. Fractalkine의 발현 변화는 Northern 및 Western 분석으로 확인하였고 pioglitazone의 NF-kappa B 활성억제 효과는 Electrophoretic mobility shift assay(EMSA)로 확인하였다. 혈관평활근세포에서 TNF-α는 fractalkine의 발현을 현저히 증가시켰고 pioglitazone은 TNF-α에 의해 증가된 fractalkine의 mRNA 및 protein 발현을 용량 의존적으로 억제하였다. Pioglitazone에 의한 fractalkine 발현 억제 효과가 전사수준에서 일어나는지를 알아보기 위해 promoter 분석을 한 결과 FBS에 의해 증가된 fractalkine promoter 활성이 pioglitazone에 의해 억제됨을 확인하였다. 마지막으로 EMSA를 통해 pioglitazone의 NF-kappa B 활성억제 효과를 확인한 결과 TNF-α에 의해 증가된 NF-kappa B의 DNA 결합 능력이 pioglitazone에 의해 억제됨을 확인하였다. 결론적으로 본 연구를 통해 pioglitazone은 전사인자 NF-kappa B의 활성억제를 통하여 fractalkine 발현을 억제하며 이러한 pioglitazone의 항염증 작용은 fractalkine의 발현이 증가되는 죽상동맥경화증 및 나아가서는 만성 염증성 질환의 치료 약제로 사용할 수 있음을 시사해준다. Atherosclerosis is chronic inflammatory process developed by endothelial cell dysfunction, inflammatory cell infiltration, vascular smooth muscle cell proliferation and migration. Chemokines are major regulatory proteins for the recruitment and trafficking of leukocytes. Fractalkine is the sole member of the CX3C family of the chemokines, and has unique structural and functional attributes. Macrovascular complication by atherosclerosis is the primary cause of death in subjects with diabetes. Recently, peroxisome proliferator-activated receptor-γ (PPAR-γ) agonists, oral insulin sensitizers, are used extensively in the treatment of insulin resistance and type 2 diabetes: therefore, the impact of PPAR-γ agonists on atherosclerosis is important. PPAR-γ ligands have been shown to inhibit endothelial expression of adhesion molecules or chemokines, which induce monocyte infiltration into the vessel wall. Therefore, we investigated the effect of pioglitazone (PPAR-γ agonist) on the TNF-α-stimulated fractalkine expression in the rat aortic smooth muscle cells (RASMCs). Vascular smooth muscle cells are isolated from in the 100 g, 4-week sprague-Dawley rat and cultured in vitro. We used TNF-α as a stimulation agent for fractalkine expression. Northern and western blot analysis were used to observe changes in fractalkine expression. Inhibitory action of pioglitazone on fractalkine expression at the trascriptional level was evaluated by FBS-stimulated fractalkine promoter activity assay. Using eletrophoretic mobility shift assay we identified the inhibitory effect of pioglitazone on the NF-kappa B DNA binding activity. In summary, pioglitazone inhibited TNF-α-stimulated fractalkine mRNA expression and protein expression by dose-dependent manner in RASMCs. And pioglitazone inhibited FBS-stimulated fractalkine promoter activity in RASMCs. Finally pioglitazone inhibited TNF-α-stimulated NF-kappa B DNA binding activity in RASMCs. These results indicated that pioglitazone has protective effect on the atherosclerosis partly by inhibiting TNF-α-stimulated fractalkine expression through NF-kappa B pathway.