인체 간암세포주 Huh7에서 시안산이 AMP 활성화 단백질인산화 효소, 이소시트르산 탈수소효소와 세포자멸사에 미치는 영향

Abstract

요소는 신기능 악화로 인해 체내에 축적되어 요독 증후군을 일으키는 대표 인자로 체내에서 암모니아와 시안산으로 전환된다. 만성 콩팥병 환자에서 이러한 시안산의 생성이 에너지 대사에 미치는 영향을 확인하기 위해, 인체 에너지 대사의 주요 효소의 변화와 세포자멸사에 대한 영향을 파악하였다. 에너지 대사의 주요 효소로는 AMP 활성화 단백질인산화 효소와 TCA 회로 효소인 이소시트르산탈수소효소의 활성 변화를 확인하였고, 이는 에너지 생성의 주된 세포인 간세포, Huh7을 이용하였다. 인체 간암세포주 Huh7 에 시안산을 처리한 후 세포 생존 정도 검사, 세포자멸사 관련 인자들 및 AMP 활성화 단백질인산화 효소에 대한 Western blot 분석, 이소시트르산탈수소효소의 활성 측정 및 이에 대한 역전사 종합효소 연쇄반응을 시행하였다. 시안산 농도와 노출시간에 따라 Huh 7 세포가 검게 변화되었고, 생존 능력 또한 감소하였다. 세포자멸사 관련 인자들에 대한 Western blot 결과, PARP의 단백질은 절단되었으며, p53은 시안산 처치 후 강하게 발현되었다. 시안산의 처치 시간에 비례하여 유리된 시트크롬 c와 XIAP 는 감소하였고, cIAP는 시안산 처치 후 발현이 증가하였다. Huh7 세포에 시안산을 처치 후 시간에 따른 AMP 활성화 단백질인산화 효소의 단백 발현 변화를 Western blot 분석을 시행한 결과 발현 정도가 감소함을 확인할 수 있었다. 시안산을 처치했을 때 이소시트르산탈수소효소 활성은 대조군에 비해 증가되었으나, 이소시트르산탈수소효소에 대한 역전사 중합효소 연쇄 반응의 결과 시안산을 처치했을 때 이소시트르산탈수소효소에 대한 mRNA 발현은 감소되었다. 본 연구 결과, 요독 물질인 시안산은 간세포에서 세포자멸사를 유도하며, 에너지 대사를 억제하고, TCA 회로의 활성화를 유도하는 것으로 생각되며, 이는 만성 콩팥병 환자의 피로감, 골근육계 이상, 저체온증 등의 에너지 생성 기능의 저하를 초래하는 것으로 판단된다.

Urea is a major factor of uremic syndrome which is accumulated by decreased kidney function. It can be degraded by ammonia and cyanate. The alteration of major enzyme for energy metabolism and effectiveness of apoptosis were studied to confirm the impact of cyanate on energy metabolism. AMP activated protein (p-AMP) kinase and isocitrate dehydrogenase (IDH) (major enzymes of energy metabolism) were checked by using Huh7, a key cell in the creation of energy. After cyanate processing to Huh7, we analyzed the viability of the cell and performed western blot analysis on p-AMP kinase and apoptotic factors. The viability of the Huh7 cell was decreased in proportion to the concentration and exposure time to cyanate. According to the western blot analysis on cell apoptotic factors, the PARP protein was cleaved. p53 was strongly expressed and p-AMP kinase decreased as time passes after cyanate processing. Although IDH activity was increased compared with the control, the expression of mRNA was decreased after cyanate processing. In this study, cyanate induced apoptosis in Huh7 cells, activated TCA cycle, and inhibited energy metabolism. As a result, it leads to decline of energy generation, which makes patients with chronic kidney disease meet with uremic symptom like fatigue.