16S rRNA 유전자를 이용한 Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae 및 Streptococcus agalactiae 의 검출

Abstract

Background : Delayed treatment of acute bacterial meningitis often causes death or serious neurological defects. Rapid and accurate diagnosis is very important for effective treatment. Although the Gram stain and latex agglutination test for major causative bacteria, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae and Streptococcus agalactiae, are useful for early detection of acute bacterial meningitis, their sensitivity is not satisfactory. In this study, we purpose to develop a PCR strategy for the simultaneous detection of N. meningitidis, H. influenzae, S. pneumoniae and S. agalactiae. Methods : Primers were designed from the 16S rRNA genes of N. meningitidis, H. influenzae, S. pneumoniae and S. agalactiae, which were constituted with 3 senses and 5 antisenses, and 7 primer pairs. The PCR assay was divided into two steps, the first PCR resulted in a general bacterial amplicon with universal primers, and the second were performed with species specific primer pairs in four combination reaction tubes. PCR sensitivity and specificity were tested to clinical isolates of 4 N. meningitidis, 3 H. influenzae, 14 S. pneumoniae, 6 S. agalactiae, 14 Staphylococcus epidermidis, and 25 reference strains of different species. Results : The species specific primer pairs showed specific DNA amplification to all clinical isolates tested. All 25 reference strains of different species and S. epidermidis were distinguished from N. meningitidis, H. influenzae, S. pneumoniae and S. agalactiae except for Pseudomonas aeruginosa, Neisseria and Candida species, The PCR detection limit for S. agalactiae was 200 CFU. Conclusions : The seminested PCR using bacterial 16S rRNA gene was sensitive and specific for the detection of Neisseria species, H. influenzae, S. pneumoniae and S. agalactiae. This results warranted the application of this method to cerebrospinal fluids to diagnose bacterial meningitis.

배경 : 사망률이 높고 심각한 신경학적 후유증을 유발할 수 있 는 급성 세균성 수막염의 효율적인 치료를 위해 원인균의 빠르고 정확한 검출이 필요하다. Gram 염색과 라텍스 응집법은 조기 검 출에 이용되고 있으나, 민감도가 떨어져 최근 분자생물학적 방법 으로 급성 세균성 수막염의 원인균을 검출하고자 하는 시도가 이 루어지고 있다. 이 연구에서는 급성 세균성 수막염의 주요 원인 균인 H. influenzae, N. meningitidis, S. pneumoniae 및 S. agalactiae의 조기 검출을 위해 16S rRNA 유전자에 대해 균종 별 다중 시발체를 고안하여 이중 중합효소연쇄반응을 이용한 동 시 검출방법을 시도하였다.방법 : H. influenzae, N. meningitidis, S. pneumoniae 및 S. agalactiae의 16S rRNA 유전자에 작용하는 sense 3종과 antisense 5종의 시발체를 고안하여 7종의 시발체 조합으로 분류하였 다. 중합효소연쇄반응은 universal 시발체로 균종의 16S rRNA 유전자를 공통적으로 일차 증폭한 후, 균종별 동정이 가능하도록 시발체를 적절히 구성한 4가지 조합의 다중시발체 중합효소연쇄 반응을 시행하였다. 민감도와 특이도는 임상검체에서 분리된 H. influenzae 3주, N. meningitidis 4주, S. pneumoniae 14주, S. agalactiae 6주, S. epidermidis 14주와 표준균주 25주를 대상으 로 실시하였다. 결과 : 임상검체에서 분리된 H. influenzae, N. meningitidis, S. pneumoniae와 S. agalactiae 27균주를 대상으로 다중시발체 중합효소연쇄반응은 결합온도를 56℃로 시행한 경우 85.2%, 61 ℃의 경우 92.6%의 민감도를 보였다. 균종별 특이 시발체의 타 균종과의 교차반응은 N. meningitidis의 시발체 조합은 전체 26 균종 중 P. aerugninosa와 Neisseria species를 제외한 22균주에 서 특이도를 보였고, Candida species는 H. influenzae와 S. pneumoniae의 특이 시발체에 교차반응이 있었으나, 다른 시발체 에서도 추가로 증폭산물이 관찰되어 구별할 수 있었다. Candida species을 제외한 표준균주에서 H. influenzae, S. pneumoniae, S. agalactiae의 시발체 조합은 대상 균주 모두에서 특이도를 보 였다. S. agalactiae을 대상으로 실시한 검출감도는 결합온도를 56℃로 시행시 200 CFU로 나타났다. 결론 : 이 연구에서 16S rRNA 유전자를 대상으로 고안한 다 중시발체 중합효소연쇄반응이 급성 세균성 수막염을 유발할 수 있는 H. influenzae, N. meningitidis, S. pneumoniae, S. agalactiae에 높은 민감도와 특이도를 가지고 있었다. 이후 실험 대상 에 포함되어 있지 않은 균종 및 상재균에 대한 검증과 임상 적용 에 대한 연구가 따라야 할 것으로 생각된다.