Gambogic Acid Induced Apoptosis through Activation of Caspase-dependent Pathway in Aortic Smooth Muscle Cells

Abstract

Gambogic acid (GA) has powerful apoptotic actions. The authors investigated whether GA has apoptotic effects on aortic smooth muscle cells, and compared its potency with that of simvastatin. Smooth muscle cells were isolated from the aortas of Sprague-Dawley rats (4-6 week). Cell purities were confirmed by IF staining using α-smooth muscle actin antibody. The IC50 values for cell death by GA and simvastatin were determined using a MTT assay, and the apoptotic effects of 1 μM GA or 30 μM simvastatin (concentrations correspond to IC50 values) were determined after 24 h of treatment using live cell images and by FITC annexin-V and propidium iodide double-staining. In addition, western blotting was used to evaluate apoptosis by quantifying reductions in the expression levels of the PARP and procaspase-3 as well as cleavages of PARP and procaspase-3 after treatment with 1 μM GA or 30 μM simvastatin. The IC50 of GA (1 μM) was lower than that of simvastatin (30 μM). Cell numbers were markedly reduced by both drugs in live cell images. GA (1 μM) produced a higher level of apoptosis than 30 μM simvastatin (26.4±2.37% vs. 8.3±1.54%, respectively; P⁄0.05, n=3) by FITC annexin-V & PI double-staining. In addition, 1 μM GA reduced the expressions of PARP, procaspase-3, and Mcl- 1 in cells, whereas 30 μM simvastatin did not. Pretreatment with z-VAD-fmk attenuated GA-induced apoptosis and the cleavages of PARP and procaspase-3. The decreased level of Mcl-1 protein induced by GA treatment was recovered by z-VAD-fmk. These results indicate that GA-induced apoptosis was mediated by a caspase-dependent pathway.

간추림 : Gambogic acid (GA)는 강력한 항암효과를 가진다. 민무늬근육세포의 증식과 이동은 죽상동맥경화증의 발병기전에 있어 중요한 역할을 한다. 이 연구는 GA가 대동맥 민무늬근육세포에 대하여 세포사멸 효과가 있는 지를 조사하였고, simvastatin에 비해 GA의 효과가 얼마나 유용한지를 연구하였다. 대동맥 민무늬근육세포는 4-6주 된 Sprague-Dawley 흰쥐에서 분리하였다. 이들 세포는 민무늬근육의 α-액틴 항체로 면역형광염색법으로 확인하였다. MTT 방법으로 GA와 simvastatin의 IC50을 결정하였다. 약제 각각의 IC50으로 24시간 처리한 후, 살아있는 세포영상 분석, 형광물질이 표지된 annexin V와 propium iodide로 이중염 색하여 세포사멸 정도 분석을 각각 시행하였다. 또한, western blot으로 민무늬근육세포에서 PARP 및 procaspase- 3의 감소와 PARP 및 procaspase-3의 분할을 보고, 세포사멸임을 검증하였다. GA의 IC50인 1 μM은 simvastatin의 IC50인 30 μM보다 낮았는데, 이는 IC50만으로 보았을 때 GA가 simvastatin 보다 더 강력한 약제임을 보여주었다. 또한 세포영상에서 약제종류와는 상관없이 약제처리 24시간 후, 처리하지 않은 대조군에 비해 세포의 수가 상당이 감소되었다. GA 처리군 (26.4±2.37%)에서 simvastatin 처리군 (8.3± 1.54%)에 비해 세포사멸된 세포들이 더 높은 백분율을 나타냈다 (P⁄0.05, n=3). 또한 GA를 처리하면 PARP, procapase-3, 그리고 Mcl-1의 발현을 감소시켰지만, simvastatin을 처리 한 경우에는 없었다. z-VAD-fmk로 전처 리 후, PARP와 procaspase-3의 분할 뿐만 아니라 GA에 의해 유도된 세포사멸이 감쇄되었다. GA에 의해 유발 된 Mcl-1 단백질 발현의 감소는 z-VAD-fmk에 의해 복구되었다. 이들 결과는 GA에 의해 유도된 세포사멸이 caspase 의존성 경로를 통해 일어난다는 것을 의미한다.