Effects of TissueType Plasminogen Activator and Hemoglobin on the HypoxiaReoxygenation-Induced Injury in HT22 Cells : Protective Effect of Antioxidants

Abstract

Using an in vitro ischemic stroke HT-22 cell model, neuronal injury under hypoxic and reoxygenation conditions was investigated in this study to provide insights into the associated mechanisms. Results showed that cell survival decreased progressively with reoxygenation time, indicating that reperfusion exacerbates neuronal injury. Tissue-type plasminogen activator (tPA), a standard ischemic stroke treatment, was found to induce neurotoxicity in a concentration-dependent manner by increasing reactive oxygen species (ROS), lactate dehydrogenase release, and apoptosis markers. tPA’s neurotoxicity was amplified in combination with hemoglobin (Hb), leading to further reduced cell viability and increased ROS levels, which underscored the need to manage the risks of hemorrhagic transformation post-tPA treatment. Epigallocatechin gallate (EGCG) was identified as a promoising neuroprotective agent that can effectively preserve cell viability and restore the levels of apoptotic markers and ROS. Resveratrol was also identified as a promising neuroprotective agent with the ability to restore the altered levels of ER stress and apoptosis markers. In conclusion, the established HT-22 cell model successfully simulated ischemic stroke and reperfusion injury in vitro, facilitating the identification of EGCG and resveratrol as potential adjunct therapies to mitigate the neurotoxicity of tPA and Hb, supporting further investigation into their efficacy in ischemic stroke therapy.

본 연구는 저산소 및 재산소화 조건에서 신경 손상을 모방하기 위해 HT-22 세포를 활용한 시험관 내 허혈성 뇌졸중 모델을 제시하며, 허혈 및 재관류로 인한 신경 독성에 대한 새로운 통찰을 제공한다. HT-22 세포는 무포도당 배지에서 배양된 뒤 18시간 동안 저산소 상태에 노출되었으며, 이후 3, 6, 또는 22시간 동안 재산소화 과정을 거쳤다. 실험 결과, 재산소화 시간이 증가함에 따라 세포 생존율이 점진적으로 감소했으며, 이는 재관류가 신경 손상을 악화시킬 수 있음을 시사한다. 허혈성 뇌졸중의 표준 치료제인 tissue-type plasminogen activator (tPA)는 활성산소종(reactive oxygen species, ROS) 생성, lactate dehydrogenase 방출, 및 세포자멸사 마커를 증가시키며 농도에 따라 신경 독성을 유발하는 것으로 나타났다. 특히, tPA와 hemoglobin (Hb)이 병용될 경우 독성이 더욱 강해져 세포 생존율이 크게 감소하고 ROS가 증가하여, tPA 투여 후 출혈성 전환의 위험성을 강조한다. 신경 보호제를 찾기 위해, tPA 및 Hb 처리 조건 하에서 10가지 화합물을 스크리닝한 결과, epigallocatechin gallate (EGCG)와 resveratrol이 유망한 후보로 확인되었다. 이 두 물질은 ROS, 세포자멸사 및 소포체 스트레스 마커를 감소시키며 농도 의존적인 신경 보호 효과를 보였다. EGCG는 50 μM 농도에서 세포 생존율을 효과적으로 유지시키며, 세포자멸사 마커와 ROS 생성을 대조군 수준으로 회복시켰으나, 고농도에서는 세포 독성이 관찰되었다. Resveratrol 또한 소포체 스트레스를 완화하고, Bcl-2 수준을 회복하며, 세포자멸사 마커를 감소시킴으로써 신경 보호 효과를 나타냈으며, 최적의 효과는 50 μM에서 관찰되었다. 결론적으로, HT-22 기반 모델은 허혈성 뇌졸중 및 재관류 손상을 성공적으로 재현하였으며, 신경 보호 전략을 평가할 수 있는 유용한 플랫폼을 제공한다. EGCG와 resveratrol은 tPA와 Hb로 인한 신경 독성을 완화할 수 있는 보조 치료제로서의 가능성을 보여주었으며, 허혈성 뇌졸중 치료에서 이들의 잠재적 역할을 밝혀내기 위한 추가 연구의 필요성을 제시한다.